甲基化檢測服務(wù)
實(shí)驗(yàn)原理
DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶( DNMTS)的作用下使CpG二核苷酸5～端的胞喀啶轉(zhuǎn)變?yōu)?”-甲基胞喀啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。
注:M:甲基化引物PCR擴(kuò)増;U:非甲基化引物PCR擴(kuò)増。SW1353細(xì)胞在藥物處理后從完全甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆羌谆�，OUMS-27細(xì)胞在5-Aza-dC處理后從部分甲基化部分非甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆羌谆?
Northern或 Southern Blot檢測服務(wù)
實(shí)驗(yàn)原理
Southern雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的方法，由 Southern于1975年創(chuàng)建，稱為 Southerne印跡技術(shù)。其原理為利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的DG標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。
Northerne印跡雜交( Northern blot)是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法，主要利用堿基配對原則，利用特性的DNA探針與其雜交，經(jīng)過顯影技術(shù)分析RNA的最和大小。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為 Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為 Western blot
實(shí)驗(yàn)流程
a) Northern Blot
1.完整mRNA的分離
2.根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進(jìn)行分離
3.將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，在轉(zhuǎn)移的過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布
4.將RNA固定到支持物上
5.固相RNA與探針分子雜交
6.除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子
7.對特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測、捕獲和分析
b）Southern Blot
1、制備待測DNA2、DNA限制酶消化
3、瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品
4、電泳凝膠預(yù)處理
5、轉(zhuǎn)膜
6、探針標(biāo)記
7、預(yù)雜交
8、 Southern雜交
9、洗膜
10、放射性自顯影檢測
11、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及報(bào)告
樣本要求
1.新鮮組織:
用解剖刀等迅速切成小碎塊約30-100mg，放入20mL離心營中開蓋液氮速東15min.80度保存，干冰運(yùn)輸。每個northern blot泳道提供2-3管樣品。注:解剖刀處理組織的時間盡量控制在1min以內(nèi)。液氮速凍時必須開蓋以防炸裂。
2細(xì)胞樣品:
縣浮細(xì)胞1000-1500rpm，5min，常溫離心收集細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化后吹丁收集，PBS洗滌細(xì)胞，去除多余培養(yǎng)基和胰蛋白酶。開蓋液氮速凍15min，-80度保存干冰運(yùn)輸，一般情況下，細(xì)胞培養(yǎng)的6孔板每孔細(xì) |
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