實驗原理
ULICUT＆RUN是一種類似于廣泛使用的染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)的方法，在使用少量細胞(包括單細胞和單個植入前胚胎)的情形下能確定染色質(zhì)上的蛋白質(zhì)定位，適合用來研究轉(zhuǎn)錄因子和其他的DNA結(jié)合蛋白在染色質(zhì)上的定位情況。通過針對靶蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑蛋白)的抗體和 Protein A(特異結(jié)合免疫球蛋白G)的介導(dǎo)，使與 Protein A融合的微球菌核酸酶( Micrococcal Nuclease， Mnase)切割并釋放靶蛋白結(jié)合的序列，并進一步建庫測序分析，獲得轉(zhuǎn)錄因子和其他的DNA結(jié)合蛋白在染色質(zhì)上的定位情況。
目前常規(guī)的ChIP-seq用于DNA結(jié)合蛋白的全基因組作圖方法需要數(shù)萬、甚至數(shù)百萬個細胞，因此在體內(nèi)完成DNA結(jié)合蛋白的作圖十分受限，許多生物學(xué)重要意義的細胞群中的細胞數(shù)量都不大。通常，組織樣品中細胞數(shù)和細胞純度之間的平衡，會不利于ChIP-seq分析純化組織特異性細胞群。而 ULICUT＆RUN從50個細胞中獲得因子結(jié)合圖譜的能力與高細胞數(shù)的圖譜高度重疊，因此幾乎可以從任何可用的樣本進行繪圖
技術(shù)優(yōu)勢
1. ULICUT＆RUIN需要細胞量較少。最少50個細胞可完成相關(guān)檢測，降低了對高讀取覆蓋率的要求，幾乎可以從任何可用的樣本進行繪圖，非常適合用于比較難獲得的細胞并且沒有細胞培養(yǎng)模型可以準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)環(huán)境的情況下的分析，如早期胚胎細胞等樣本的檢測分析。
2.對抗體要求較低。 ULICUT＆RUN與ChIP-seqg相同的是都使用抗體，具有特異性，但是 ULICUT＆RUN對抗體要求較低，非ChIP級別的抗體也可以做。
3.靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠。 ULICUT＆RUN從50個細胞中獲得轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合圖譜的能力與高細胞數(shù)的圖譜高度重疊。
4.信噪比高。 ULICUT＆RUN采用的是靶向 Mnase的特異性DNA切割并釋放，未被切割并釋放的染色質(zhì)溶解度很差容易去除，有效降低背景，提高信噪比�？梢詸z測來自發(fā)育或疾病中特別重要的稀有細胞群的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。
Figure 1 A schematic overview of the CUT&RUNprotocol.
CUT&RUN requires less than a day from cells to DNA. Cellsare harvested and bound to concanavalin A-coatedmagnetic beads. Cell membranes are permeabilized withdigitonin (indicated by holes in the membrane)to allow thespecific antibody to find its target. After incubation with theantibody, beads are briefly washed and then incubated withPA-MN. Cells are chilled to 0'C, and digestion begins withaddition of Ca2+. Reactions are stopped by chelationincluding spike-in DNA and the DNA fragments releasedinto solution by cleavage are extracted from the |
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