DNA 測序技術(shù)主要依據(jù) Sanger 的雙脫氧鏈終止法。以 DNA 單鏈為模板，在特定條件下，用特異的引物在測序級(jí) DNA 聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，不斷將 4 種脫氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羥基末端并使引物鏈得到延伸。這種鏈的延伸是通過引物的 3'- 羥基和脫氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵來完成的。如果這種反應(yīng)體系中加入雙脫氧核糖核苷酸 (ddNTP) ，這種 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基團(tuán)是正常的 (4 種不同的熒光標(biāo)記 ) ，而 3' 位置缺少羥基，因此在 DNA 聚合酶作用下，仍然可以通過 5'- 磷酸基團(tuán)與引物鏈的 3'- 羥基反應(yīng)摻入到引物鏈中，但是由于 ddNTP 沒有 3'- 羥基，不能繼續(xù)與下一個(gè) 5'- 磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵而導(dǎo)致引物鏈延伸的終止。這樣，在測序反應(yīng)體系中， DNA 引物鏈不斷合成與偶然終止，產(chǎn)生一系列的長短不等的核苷酸鏈，然后將這些反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，即可得測序圖譜。
樣品要求
樣品類型
相應(yīng)要求
菌體
1. 說明載體抗性類型，我們提供 Amp, Kan, Tet 及 Chl 四種抗生素。
2. 提供 1ml 左右過夜培養(yǎng)的菌液，加 15% 滅菌甘油，于 Eppendorf 管中封口保存，防止交叉污染或滲漏。
3. 大量樣品測序，建議在一次性塑料培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上穿刺培養(yǎng)。
4. 建議盡量提供穿刺培養(yǎng)的菌種。
質(zhì)粒
1. 質(zhì)粒溶于適量體積雙蒸水中（不含 TE ），電泳檢測總量大于 2mg 。
2. 建議用相關(guān)試劑盒純化。
3. 如有可能，同時(shí)提供 1ml 含有相應(yīng)質(zhì)粒的菌液備用。
4. 大質(zhì)粒必需注明載體長度。
未純化 PCR 產(chǎn)物
1. 片段大于 150bp 。
2. 提供 50ul ～ 100ul PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 ( 總量 500ng-1ug) 。
3. 取 3ul 樣品，電泳檢測應(yīng)為明亮的一條帶，無雜帶。
純化 PCR 產(chǎn)物
1.PCR 產(chǎn)物溶于雙蒸水中（不含 TE ）。
2. 濃度大于 20ng/ul ，體積大于 20ul ，長片段需適當(dāng)增加量。
3. 電泳檢測條帶專一。
自備的引物
1. 濃度不低于 5pmole/ul( 或 5umol/L) ，體積大于 20ul 。
2. 隨機(jī)引物和簡并引物不能用于測序。
3. 盡可能提供引物全序列、 PCR 退火溫度，以供參考。
詳情請(qǐng)登入 http://www.shinegene.org.cn 或來電 021-54460832 |
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