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質(zhì)粒提取原理、方法選擇及常見問題
質(zhì)粒提取目的
質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴增或者表達(dá)的重要媒介，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，要想從細(xì)菌中獲得質(zhì)粒DNA,需要通過質(zhì)粒提取的方法。
質(zhì)粒提取的幾種方法及原理
質(zhì)粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1、堿裂解法原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細(xì)菌懸浮于含Triton
X-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質(zhì)粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法：由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機械力后細(xì)菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質(zhì)粒DNA會變性，機械力消失后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性快，仍溶于溶液而細(xì)菌染色體DNA復(fù)性較慢，會形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA
。
質(zhì)粒提取方法選擇
質(zhì)粒提取的方法主要根據(jù)質(zhì)粒DNA分子量的大小，所用細(xì)菌的種屬，細(xì)菌裂解釋放DNA后的純化方法和實驗要求來選擇。
1、質(zhì)粒DNA的分子大于15kb時，在質(zhì)粒抽提過程中容易受損，可以采用比較溫和的裂解方法，將細(xì)菌懸浮于等滲 |
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