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廣州競(jìng)遠(yuǎn)生物科技有限公司
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| 細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)（2） |
Annexin V/PII雙染法
細(xì)胞凋亡研究不僅受到基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)界的重視，也日益受到臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的青睞。通過檢測(cè)藥物、基因或蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因的影響，在腫瘤防治、老年癡呆、艾滋病、自身免疫病，心肌梗塞等研究上都發(fā)揮著積極的作用。
3、流式鑒定細(xì)胞表面抗體
實(shí)驗(yàn)原理
基本原理就是用熒光標(biāo)記的單克隆抗體來識(shí)別細(xì)胞表面的抗原(也就是所謂的表面標(biāo)記)，然后通過流式細(xì)胞儀來檢驗(yàn)表面抗原的多少和種類(也就是熒光強(qiáng)度，代表了抗體結(jié)合的種類和數(shù)量)來鑒定細(xì)胞是哪類
應(yīng)用
細(xì)胞鑒定分類等，檢測(cè)陽性表達(dá)細(xì)胞的比例。
實(shí)驗(yàn)流程
1、制備樣品的單細(xì)胞懸液
2、標(biāo)記流式抗體
3、流式上機(jī)檢測(cè)。
4、活性氧(ROS)檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)原理
活性氧檢測(cè)( Reactive Oxygen Species Assay Kit是一種基于熒光染料 DCFH-DA(2，7- Dichlorodi- hydrofluoresceindiacetate)的芡光強(qiáng)度變化，定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的*常用方法。
DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不會(huì)通透細(xì)胞膜，因此探針很容易被積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠氧化無熒光的DCFH生成有芡光的DCF。綠色熒光強(qiáng)度與活性氧的水平成正比。在*大激發(fā)波長480nm，*大發(fā)射波長525nm處，使用熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等檢測(cè)熒光信號(hào)。 Rosup為活性氧陽性誘導(dǎo)藥物，根據(jù)其芡光信號(hào)強(qiáng)度，可分析活性氧的真正水平。
檢測(cè)
原位裝載探針法:激光共聚焦顯徴鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集細(xì)胞后裝載探針:用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
4、線粒體膜電位檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)原理
JC-1是一種碳氰化合物類陽離子芡光染料，可作為檢測(cè)線粒體跨膜電位指示劑。JC-1在細(xì)胞內(nèi)以聚合體和單體兩種不同的物理形式存在，分別處于不同的熒光發(fā)射峰。當(dāng)JC-1濃度低或膜電位水平低時(shí)，主要以單體形式存在，激發(fā)波長為527nm，呈綠色熒光;當(dāng)丁C-1濃度升高或線粒體膜電位水平較高時(shí)，形成聚合物，發(fā)出紅色的芡光，激發(fā)波長為590nm。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光，根椐這特征就可以檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
實(shí)驗(yàn)流程
1.細(xì)胞培養(yǎng);
2.用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組，收集細(xì)胞;
3.用PBS洗滌細(xì)胞三次，收集不多于1×10的細(xì)胞;
4.取100pL10× Incubation Buffer/加900L滅菌去離子水稀釋成1 |
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